大脑的功能仰赖于多脑区不同类型神经元间的信息流动，这种信息的流动依赖于跨脑区的长程投射，因此绘制脑投射图谱是理解大脑功能的基础。由于脑区内不同神经元的投射模式具有多样性，绘制脑投射图谱需要重构单神经元的完整形态，而实现这一点需要全脑亚微米高分辨率成像。目前使用光学成像方法重构单神经元完整形态面临至少三大挑战。由于脑中神经元排布致密，单神经元重构需要稀疏标记少量的神经元。神经元的轴突末梢细小，即使在稀疏标记的情况下，也需要以亚微米分辨率对大脑进行完整成像。小鼠大脑高分辨率成像，即使用目前先进的成像方法，一般也需要1-2周的连续成像，产生约20T的数据。由于神经元的形态复杂，目前还没有完全自动的追踪算法，从海量数据中半自动重构单神经元完整形态是数据处理的一大挑战。

为提高全脑高分辨率成像的速度并降低成像的数据量，清华大学郭增才课题组开发了mLSFM和SMART两套成像系统，实现了高速、高分辨率、高对比度小鼠全脑成像，以支持重构稀疏标记神经元的完整形态。

2021年9月24日，清华大学医学院、清华-北大生命科学联合中心、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院郭增才课题组于《神经解剖学前沿》（frontiers in Neuroanatomy）在线发表了题为“多尺度光片荧光显微镜mLSFM”（Multi-Scale Light-Sheet Fluorescence Microscopy for Fast Whole Brain Imaging）的研究论文，报道了光片荧光显微镜非常适合多尺度成像，通过结合光片平铺、自动变倍、自动切片与组织膨胀透明技术，可实现从细胞到亚微米空间尺度对小鼠全脑的高速成像。

研究者首先发现，光片荧光显微镜相比宽场荧光显微镜在多尺度成像上具有独特优势。宽场荧光显微镜一般使用同一物镜实现样本的照明和检测（图1B），而光片成像将照明和检测两条光路分离开（图1A）。采用商品化标准物镜（图1C），光片成像中信号亮度与光收集能力和物镜放大倍数间的关系不同于传统宽场荧光显微镜（图1D、E）。在光片成像中，即使使用低放大倍数物镜，信号亮度反而比使用高放大倍数时更高。

图1. 光片荧光显微镜和传统宽场荧光显微镜的信号亮度

由此，使用LSFM进行多尺度成像会有极大优势。研究者基于上述理念，自主搭建了多尺度光片荧光显微镜mLSFM系统：光片平铺技术和自动周期切片策略保证了全脑突触分辨率成像从始至终的稳定；自动光学变倍变焦和光片厚度调整策略使得成像时可以灵活调整放大倍率同时保证图像质量。研究者利用mLSFM系统进行了多种目的和用途的成像，电极位置重构、亚微米分辨率轴突投射成像（图2）、内侧前额叶皮质（medial Prefrontal Cortex，mPFC）单个神经元完整形态追踪（图3），这些成像任务均可在若干小时内完成。鉴于以上理论分析与实验展示，mLSFM系统将为全脑神经结构的进一步探索提供帮助。

图2.  CUBIC-X透明Thy1-YFP-H小鼠全脑成像

图3. mPFC稀疏标记神经元全脑多尺度成像追踪

2021年10月1日，清华大学医学院、清华-北大生命科学联合中心、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院郭增才课题组于《Cell Reports Methods》在线发表了题为“高速高分辨率全脑稀疏成像”（Sparse imaging and reconstruction tomography for high-speed high-resolution whole-brain imaging）的研究论文，报道提出一种利用转盘共聚焦进行高分辨率快速成像的SMART（sparse imaging and reconstruction tomography）系统。

SMART系统的光路主要由转盘共聚焦单元，sCMOS（scientific complementary-metal-oxide semiconductor） 相机以及40倍油镜（NA 1.3） 组成，每个体素大小为0.3 × 0.3 × 1.0 μm3。成像过程中，步机电机控制搭载透明脑样品的位移台不断移动以实现对各区域信号的获取；每当一层的数据采集完毕后，振动切片机将会接收指令切除样本表层，然后进行下一个循环，周而复始直至完成对全脑的成像（图1 A）。

图1.SMART系统成像原理

由于信号部分在整个透明脑样本中占比极低，因而对全部区域进行成像似乎是费时费力但又收效不高的，这也是已有的全脑成像技术提高成像速度的一大阻碍。如果能够做到只对有信号的部分进行成像，那么成像效率将会大大提高。研究者巧妙地利用了“信号的连续性”这一特点，如果一个立方体表面均没有信号穿过，那么这个立方体内则没有信号（图1D）。通过仅对有信号的区域进行高分辨率成像，可将待成像区域、成像时间以及数据规模降至全脑成像的10%左右（图1 B、C）。

图2.SMART系统成像效果展示及神经元形态分析

采用SMART系统，研究者分别在初级视觉皮层（V1），前额叶皮层（mPFC），前外侧运动皮层（ALM）处注射病毒并进行全脑成像，完整重构了29个神经元（图2 B）。单神经元重构展示了神经元结构的复杂性，部分神经元的轴突有近千个分叉，总长度接近半米。

清华大学医学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院郭增才研究员为mLSFM成像系统一文通讯作者。清华大学生命学院2014级博士张洲洲、2020级博士生姚啸、2015级博士尹鑫鑫为并列第一作者，2016级硕士黄天怡、2015级博士生火炎、实验室研究助理季汝南、东南大学艾伦联合研究中心彭汉川教授与Ding Zhangcan硕士共同参与了该课题的研究。

清华大学医学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院郭增才研究员为SMART成像系统一文通讯作者。清华大学生命学院2014级博士陈瀚、医学院2016级硕士黄天怡和2018级博士生杨月鑫为并列第一作者；2020级博士生姚啸、2015级博士生火炎、2016级博士生王玉、2019级博士生赵闻语、实验室研究助理季汝南、实验室已出站博后阳弘江博士共同参与了该课题的研究。

两项研究工作均得到了国家自然科学基金（31871048）与清华-IDG/麦戈文脑科学研究院Brain+X基金的资助。郭增才课题组受到清华－北大生命科学联合中心和清华-IDG/麦戈文脑科学研究院的支持。