Ca2+信号在大脑中起着至关重要的作用，与膜兴奋性、细胞感知、突触传递等重要事件密切关联[1]。Ca2+失调也被认为与多种精神障碍有关，如帕金森综合症、阿尔茨海默氏病、癫痫和精神分裂症[2]。除了可作为神经元响应的急性指标（如发放动作电位），Ca2+也介导慢性/非急性生物学过程：Ca2+依赖的基因转录和表达、神经突起的生长或修剪、LTP或LTD、学习与记忆，以及神经退变等[3]。因此，发展钙成像相关分子工具，以监测细胞、组织、器官乃至整个生命体的长期Ca2+动态（天/周或更长时间），将有力促进对神经元发育及可塑性等长时程生物学过程的深入理解。
事实上，以GCaMP为代表的基因编码Ca2+指示器（genetically encoded Ca2+ indicators，GECIs），已被广泛应用于神经元等细胞的钙荧光成像[4]。按照预期，GECIs可在一定程度上避免电极经常遇到的慢性免疫反应和记录质量不稳定等问题[5]。然而，通过病毒感染[6]或转基因方式[7]长期表达GCaMP的神经元常常出现细胞损伤甚至凋亡（以GCaMP异常核聚集为标志）。作者的前期工作提示：GCaMP神经元毒性的主要原因是L型CaV1通道等含有apoCaM结合域的重要蛋白与GCaMP意外结合[8]。目前，通常采取的解决办法是针对特定的实验条件对表达水平/时间进行试探性预实验，进而根据经验数据规避GCaMP损伤。在本项研究中，针对传统GCaMP探针的固有细胞毒性，作者利用理性设计的高细胞相容性GCaMP-X，挑战钙探针的长期表达及长时程神经元钙成像，提供了新的解决方案。
日前，北京航空航天大学刘晓冬课题组、清华大学医学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院郭增才课题组及北京航空航天大学樊瑜波教授/杨亚雄副教授团队合作在eLife上发表了题为“Chronic Ca2+ imaging of cortical neurons with long-term expression of GCaMP-X”的研究论文，进一步展示了GCaMP-X优于GCaMP的神经元相容性，实现了离体培养神经元（共聚焦）和活体小鼠大脑皮层（双光子）的长时程GCaMP-X成像，定量揭示了自发钙振荡（异常）与神经元形态发育（损伤）的紧密关联，为神经科学及相关领域的长期钙成像提供了简便而有效的新方案。
在皮层神经元中，自发性钙振荡（主要来源为L型钙通道的钙离子内流）调控神经元突起的生长，称为通道钙动态-神经元发育耦联[9]。GCaMP与L型钙通道意外结合进而干扰上述耦联，长期（高）表达GCaMP最终造成了神经元明显的损伤。作者根据实验室此前GCaMP-X探针的设计原理，“理性设计”了jGCaMP7b-XC和jGCaMP7b-XN。为了探究GCaMP7和GCaMP7b-X对细胞的不同毒性，作者将不同探针转染至皮层神经元中，发现jGCaMP7b表现出严重的核积累，且jGCaMP7b表达的神经元突起总长度和复杂度显著降低，而jGCaMP7b-X表达的神经元形态学和YFP 对照组没有显著性差异。为了研究jGCaMP7b和jGCaMP7b-X对L型钙通道的影响，作者使用电生理探究其对HEK293细胞中重组CaV1.3通道的影响，结果显示jGCaMP7b显著增强CaV1.3的通道激活与失活过程，而jGCaMP7b-XC并不影响通道特性（图1）。以上证据表明jGCaMP7b-X与GCaMP7b相比，显著减弱了神经元的毒性和对L型通道的干扰。
图1 jGCaMP7-X的设计原理及基本测试
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
为了在体内水平上探究GCaMP-X的效果，作者在成年小鼠（>2个月）分别注射GCaMP6m和GCaMP6m-X病毒，在表达4周之后不同时间点，使用双光子显微镜监测胡须刺激S1感觉皮层神经元的钙动态。结果显示，注射8-13周，GCaMP6m组显示出明显的核聚集，而GCaMP6m-XC组神经元没有入核现象（图2）。在注射后4-6周（一般被认为是GCaMP表达最佳时间窗，Optimal Time Window, OTW），GCaMP-X组小鼠胡须刺激神经元钙响应的成功率显著高于GCaMP组，且钙响应的振幅和SNR也要高于GCaMP组。在注射后8-13周（超出GCaMP表达最佳时间窗），GCaMP-X组小鼠的胡须刺激神经元钙响应的成功率高于GCaMP组及核聚集的GCaMP组神经元，且钙响应的振幅和SNR要高于GCaMP组整体及其中的核聚集神经元（图2）。以上活体感觉响应成像表明：与GCaMP相比，GCaMP-X对于长期钙动态监控有更高的响应率等优势。
图2 小鼠活体感觉响应成像中对比病毒感染GCaMP-X与GCaMP的皮层神经元
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
为更好地厘清关键细节，作者决定对在体外条件下GCaMP-X的长期表达和成像进行深入研究。文献中，各种可兴奋或不可兴奋细胞中均可观察到慢钙振荡[10]。在神经元中，振荡Ca2+信号可以提高基因表达的效率和特异性，因此在神经元功能及发育中发挥着重要作用。作者推测，对于长时程钙振荡成像，GCaMP- X和GCaMP神经元会表现出明显差异。在DIV0的皮层神经元中加入相同滴度的GCaMP或GCaMP-X，并长期表达28天后，与GCaMP表达的神经元相比，GCaMP-X表达的神经元自发性钙振荡频率更快、振幅更高、同步性更高、半高宽更小（图3）。以上结果初步刻画了培养皮层神经元钙振荡的主要特征及其随培养时长变化的情况。
图3 利用病毒表达钙探针对皮层神经元钙振荡进行长时程成像
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
自发性Ca2+振荡，尤其是慢钙振荡，与神经元突起发育等重要过程密切关联。为进一步探究神经元发育与自发性钙振荡的关系，作者使用病毒感染皮层神经元以长期表达GCaMP-X。结果显示，DIV28时GCaMP神经元突起总长度降低、胞体尺度减小；与GCaMP明显不同，GCaMP-X神经元突起总长度随着时间变化呈现S型增长，最终进入平台期（图4）。结合图3神经元自发性钙振荡的分析结果，GCaMP-X成像揭示出：自发性钙振荡振幅与神经元突起发育呈正相关，而频率与神经元突起发育呈负相关（图4D）。进一步分析表明，神经元突起及胞体的发育速度在培养周期（一个月）内，表现为钟型（bell-shape）曲线（图4E）。
图4 离体GCaMP-X长时程成像揭示自发钙振荡-神经元突起发育之间的密切关联
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
为了进一步在小鼠活体水平上探究自发性钙振荡，在成年小鼠皮层神经元中通过病毒注射表达GCaMP6m或GCaMP6m-XC，并分别在注射后4周(OTW)和注射后8-11周(超出OTW)设置两个检查点。与图2中的胡须刺激反应实验类似，即使在时间窗OTW以内，GCaMP入核神经元也呈现出异常的钙动态。OTW之外，大量神经元GCaMP6m入核，而GCaMP6m-XC很少入核（图5C）。在时间窗口期之外，GCaMP6m神经元自发钙振荡的频率和振幅显著降低，伴随异常宽的半高宽和较慢的升/降速率。相比之下，表达GCaMP6m-XC的神经元在整个实验过程中（注射后11周）保持了正常的自发钙振荡。值得提出的是，无论是在OTW内还是在OTW外，GCaMP6m-XC组成像信噪比与GCaMP6m组相比显著提高（图5）。以上证据表明：GCaMP-X能够实现长期在体钙成像，具有GCaMP不具备的优势。
图5 小鼠皮层神经元自发钙振荡长时程在体GCaMP-X成像
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
与离体分析思路一致，与活体钙振荡成像相对应，作者进一步考察了GCaMP-X在体表达对神经元形态发育的影响。分别注射不同剂量的GCaMP6m或GCaMP6m-XC AAV病毒感染成年小鼠皮层，针对不同时间点的大脑切片，对比表达不同剂量探针的神经元。实验结果表明，随着剂量增加，GCaMP的核质比逐渐增大且GCaMP亮度逐渐增大，而高剂量GCaMP-X核质能够保持在较小值。在类似于图2和图5的条件下，作者注射高剂量GCaMP6m病毒（1 × 1012 v.g./ml）和超高剂量GCaMP6m-XC病毒（1 × 1013 v.g./ml，高出10倍），以观察S1同一皮层区域受病毒表达影响的时间分布（图6C）。在注射后17天，55天，70天和92天， GCaMP6m- XC与GCaMP6m进行比较。使用共聚焦显微镜观察脑切片，长期高水平表达GCaMP6m-XC在92天不会引起核聚集，而相对较低浓度（1 × 1012 v.g./ml）的GCaMP6m在17 - 92天已经引起严重的核聚集（图6D）。同时，从55天到92天，GCaMP6m组神经元的胞体明显小于GCaMP6m-XC组。依据离体分析的结果，在体表达探针引起的神经元损伤也很可能与自发钙振荡异常密切相关。活体GCaMP-X长期表达的脑片数据表明：与GCaMP-X在体成像的优势相对应，在长期/高剂量体表达条件下，GCaMP-X在神经元损伤（即细胞相容性）方面优于GCaMP。
图6 长期在体表达GCaMP-X或GCaMP皮层神经元的对比分析
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
相对于病毒介导的GCaMP表达，转基因小鼠介导的GCaMP表达被认为是相对安全的。然而，最近的研究报道了一些转基因小鼠品系，如Ai93和Ai148，出现了癫痫样活动[11]。基于培养的转基因神经元，并从功能和形态两个方面进行了长时程成像和分析。针对6月龄Rasgrf2-2A-dCre;Ai148D小鼠大脑皮层第2/3层，使用共聚焦荧光显微镜检查脑片中GCaMP6f的表达情况（TMP诱导表达）(图7A)，观察到明显的核聚集。同时，体外培养GCaMP6f转基因神经元的神经突复杂性和长度均较GFP转基因对照组有所降低 (图7C)。功能上， GCaMP6f入核的Ai148D神经元具有较低的自发性钙振荡振幅及主频（10-100 mHz）能量。因此，GCaMP转基因鼠也存在一定的细胞毒性，并且应当遵循着与其它基因导入方式（瞬转、病毒）下GCaMP损伤类似的基本原理。
图7 GCaMP转基因小鼠皮层神经元的长时程成像
（图源：Geng et al., eLife, 2022）
文章结论与讨论，启发与展望
综上所述，本工作根据此前GCaMP-X探针的“理性设计”原则，利用“分子内保护片段”克服了传统GCaMP的弊端，实现了离体培养神经元（共聚焦）和活体小鼠大脑皮层（双光子）的长时程GCaMP-X成像，定量揭示了自发钙振荡与神经元形态发育的紧密关联，为神经科学及相关领域的长时程钙成像提供了简便而有效的新方案。同时作者也关注到，对于基于钙结合（如CaM）设计的钙探针，一般都会存在对细胞内钙离子的“缓冲效应”，而对细胞正常钙信号传导产生一定影响；GCaMP及GCaMP-X也并不例外，如何精准刻画并避免/消除上述“缓冲效应”，进而实现“生物相容”这一最终目标，尚有待今后的研究跟进。此外，在研究过程中作者发现在活细胞（尤其是原代细胞）中GCaMP-X与GCaMP的表观荧光特性（如基础荧光等）存在一定差异，这种差异可能是由于GCaMP结合目标蛋白（IQ等CaM结合域）后发生了钙结合动力学的改变，相关问题值得在未来研究工作中加以关注。最后，体外长期培养神经元在技术上仍具有挑战性，在未来的工作中应充分利用细胞长期培养方面的技术进步，以尝试探究更长时间跨度的病生理过程。总之，本工作基于GCaMP-X（相对于GCaMP）在神经元相容性等方面的比较优势，实现了长时程GCaMP-X在体/离体成像，为推广GCaMP-X的进一步应用（如神经退变等慢性过程中的钙成像等）奠定了基础。
第一作者：耿金丽（左1），汤颖君（左2），于振（右2）；
通讯作者：刘晓冬（右1）
（照片提供自：刘晓冬课题组）
本论文的共同第一作者为北京航空航天大学博士生耿金丽、清华大学（已毕业）博士生汤颖君、北京航空航天大学博士生于振，刘晓冬组已毕业硕士生高蕴溟和黎文祥也对本项研究做出了重要贡献。本文的通讯作者是刘晓冬教授（北航）、郭增才研究员（清华）及杨亚雄副教授（北航樊瑜波团队）。本研究主要得到了国家自然科学基金、北京市自然科学基金及北京市生物医学工程高精尖创新中心的支持。
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