清华麦戈文学术笔记系列 “听觉和耳聋：从基础到临床”论坛
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2017年11月1日，“听觉和耳聋：从基础到临床”研讨会在清华大学郑裕彤讲堂成功举行，本次会议由清华大学麦戈文脑研究中心和生命联合中心联合主办。在熊巍老师和张伟老师的主持下，来自斯坦福大学、霍普金斯大学、科瑞顿大学、埃默里大学、威斯康星大学、圣路易斯华盛顿大学、St. Jude儿童医院以及清华大学和解放军总医院等高校和科研机构的共十位科学家从分子遗传、发育、功能和生物学治疗等多个角度围绕听觉领域的最新研究进展和热点问题进行了探讨，并分享了他们的最新研究成果。
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遗传因素一直是耳聋的最大致病原因，而且对于致聋基因的鉴定以及对其分子机制的研究直接加深我们对听觉形成原理和致聋机制的理解。来自Johns Hopkins University的神经科学系教授Ulrich Mueller博士做了题为“The sound of silence: mechanotransduction, auditory perception and the molecular pathogenesis of deafness”的报告，Mueller教授的团队致力于研究毛细胞中的机械力传导元件，并取得了显著的研究成果。他们通过基因筛选鉴定出了许多在毛细胞机械力传导元件中发挥至关重要作用的蛋白质，并且揭示出一个之前从没有预料过的复合物（Tip-Link Complex），该复合物主要由非传统的钙黏蛋白cadherin-23（Cdh-23）和protocadherin-15（PCDH-15）组成。
另外，Mueller 团队还鉴定出了几种对于该复合物的组装以及复合物在毛细胞上机械力敏感的纤毛中的定位具有调节作用的蛋白质：TMHS，TMIE和TOMT。他们研究发现TMHS与PCDH-15结合并介导PCDH-15和TMC1&2的转运，在TMHS缺失导致Tip-link的数量减少且PCDH-15在内质网中积累；TMIE与TMHS结合，共同介导PCDH-15和TMC1的转运；TOMT蛋白结合TMC1等机械力传导元件，这些蛋白的缺失都会导致耳聋（DFNB63）。
除此之外，他们还在进一步利用表达图谱来鉴定参与听觉机械传导的离子通道。最后Mueller教授总结说，他们的研究发现了一些内耳毛细胞上机械力传导元件的组分，而且这些蛋白质也表达在其他的机械力传导系统中，该结果显示上述分子在其他机械力传导系统中发挥着更为广泛的作用。
Creighton University的David Z.Z. He教授做了题为“Molecular mechanisms underlying differences between zebrafish and mouse hair cells”的报告。何教授实验室最近发展了单个毛细胞的纤维分拣技术，结合使用RNA-seq技术，检测了斑马鱼和小鼠毛细胞的转录组，筛选出了很多两者之间不同的基因表达模式。其中他们发现，斑马鱼和小鼠都表达Tmc1，但是Tmc2在小鼠中更没有表达。另外，Kcni13&16、Kcmq4小鼠中表达，斑马鱼中并没有。除此之外，他们构建了一个基因框架用于对两者基因表达谱的研究，同时也对毛细胞的进化提供了研究依据。
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图左: Ulrich Müeller教授, 图右: David Z.Z. He教授
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作为外周听觉器官，耳蜗的正常发育直接决定一个健康的听觉系统，同时耳蜗也是一个经典的发育模型和医学移植的重要器官。Emory University医学院细胞生物学副教授、耳科学公司联合创始人Ping Chen教授以“Line up to listen and to balance: planar cell polarity in the inner ear sensory organs”为题介绍了他们团队在研究内耳感觉器官中平面细胞极性（PCP）的最新研究进展。Ping Chen教授介绍到，PCP是指沿着平面轴线上相邻细胞的协调极化，PCP信号在发育和发挥、维持组织功能中至关重要。PCP缺陷会导致大范围的内耳、肾脏、肺部、心脏、大脑、心血管系统、脊椎等的发育异常和疾病。内耳感觉器官具有进行听觉和平衡感应所必需的独特的细胞结构，毛细胞以协调的方式来获得听觉和平衡，因此PCP在听觉和平衡的感知中具有重要作用。内耳、耳蜗和前庭中的感觉器官都具有PCP的特征，PCP途径通过动纤毛（kinocilium）的运动来调控耳蜗毛细胞在发育期间偏转和定向，动毛细胞的分布会决定毛细胞束的极性。另外陈教授的团队研究了Wnt信号通路在PCP途径中可能的作用，他们发现Wnt5a、Wnt7a和Wnt11涉及PCP信号通路，其中，Wnt5a发挥着相对更加重要的作用。两种PCP基因——Vangl2（编码PCP羧基端239-521氨基酸序列）和Scribble基因至关重要，它们的缺失会导致神经细胞迁移的严重缺陷。同时，研究结果表明，抑制JNK和ROCK激酶能够明显减少神经元的迁移。之后，陈教授的团队利用酵母双杂交技术以VangI2的C-末端为诱饵，发现了蛋白Rack1，VangI2与Rack1相互作用以调节脊椎动物PCP信号通路过程中的粘附连接。Rack1是斑马鱼中多种PCP信号传导所必需的，敲除Rack1会破坏VangI2的细胞膜定位，同时Rack会抑制正常的Wnt信号。
人民解放军总医院耳鼻喉科主任杨仕明教授以“Pigs – a new experimental model for hearing research”为题，向听众介绍了一种新的耳聋研究模型——荣昌猪。杨教授讲到，对于人类疾病的研究，动物模型在很多临床研究中发挥着举足轻重的作用，选取一个好的模型至关重要。一个好的模型，必须具有以下两个特点：（1）与人类基因组同源性高，（2）耳蜗的性状、结构、功能与人类尽可能相似。他们总结了荣昌猪耳蜗的生理和形态特征，发现它们的耳蜗比人类的长25%，是一个非常好的人类耳蜗模型。杨教授的团队利用荣昌猪模型鉴定出了三种致聋基因：SOX10、KIT、MITF-M。这些研究成果为人类耳聋治疗提供的一个非常理想的模型。
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图左: Ping Chen教授, 图右: 杨仕明主任
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听觉产生的第一级细胞就是听毛细胞，毛细胞的机械敏感功能一直是一个让研究者着迷的方向。来自University of Wisconsin-Madison神经科学教授Robert Fettiplace介绍了TMC1和TMC2在听觉和听觉发育过程中的作用。Fettiplace教授讲道，毛细胞通过激活机械力电信号传导通道（MET channels）来检测到声音信号，而MET通道发挥功能需要Transmembrane channel-like（TMC）蛋白，该蛋白家族共有8个成员：TMC1-TMC8，其中，TMC1是一个长为757aa且具有6-8个穿膜区的蛋白质，研究发现TMC1和TMC2在新生的毛细胞中表达，这两种TMC成员对于MET通道发挥功能具有至关重要的作用，Fettiplace教授认为TMC1或者TMC2可能是MET通道的孔道亚基。在Robert教授的学术报告中，他介绍了TMC1和TMC2的不同点：（1）TMC2在新生儿出生几天后出现，但是在新生第一周的结尾，伴随着TMC1的出现，TMC2被下调，在此期间，MET通道和毛细胞束的结构大小和性质逐渐达到成熟状态。TMC1和TMC2都对毛细胞发育发挥作用，但是两者却没有加和性的相互作用。（2）通过记录在TMC1或者TMC2突变体中蜗轴上MET通道的电流，他们发现TMC1和TMC2具有不同的钙离子渗透能力——TMC1依赖性的离子通道比TMC2依赖性的离子通道具有相对较小的钙离子渗透性，但是TMC1依赖性的离子通道具有更强的单通道传导性和更快的适应性。（3）TMC1还独特地支持内毛细胞中的频率依赖性（Tonotopic）的电导。 在内毛细胞中而不是其他的外毛细胞中，TMC2能够持续到后期发育阶段。此外，Fettiplace教授还介绍道，TMC1突变会导致常染色体显性耳聋（DFNA36）隐性耳聋（DFNB7/11），但是TMC2对于听力并没有任何影响；TMC1定位于毛细胞的静纤毛中，而且通过利用mCherry标记TMC1的表达他们发现在外耳毛细胞中，TMC1的数量从毛细胞顶端到基地部位逐渐增加，但是在内耳细胞中没有发现这种变化。TMC1对于毛细胞的信号传导至关重要，因为在TMC1和TMC2共同敲除的小鼠中听力丧失，但是在TMC2敲除的小鼠中能够检测到电流（直到小鼠发育到P7阶段）。最后，Fettiplace教授总结了关于TMC近来的研究成果：在出生后早期的发育过程中，表达有TMC2的离子通道向含有TMC1离子通道的转变导致耳蜗内耳毛细胞上MET通道的成熟，TMC1通道具有更高的传导性和更快的适应性。因此Fettiplace教授认为，耳蜗毛细胞上MET通道的孔道特性主要是由TMC1决定的，而且每一个MET位点离子通道的数量都不同——从顶端到基部逐渐增加，每一个离子通道复合物都需要多个TMC1分子，它们可能是以协同的方式进行运作。
Stanford University的Anthony Ricci教授介绍了毛细胞上毛束的特性，他报告的题目为“Mode of hair bundle stimulation alters output response”。在耳中，毛束可以作为独立实体存在，也可以部分或者全部集中在一片多负荷的细胞膜上。Ricci教授说在哺乳动物的耳蜗中，外耳毛细胞的毛束集中在毛细胞顶端的细胞膜上，然而内耳毛细胞毛束则自由分布，最近有研究结果表明哺乳动物耳蜗中的毛束比负责低频率声音信号的毛束分布较为稀疏。此外，Ricci教授介绍了他们的团队利用电生理技术发现的有趣的现象——使用玻璃电极刺激毛细胞会诱发快速的激活和适应性反应，而且该过程中快速的适应性反应并不依赖于Ca2+通道的开放，然而，使用气流刺激毛细胞产生的却是较慢的且Ca2+依赖性的适应过程。接下来，Ricci团队使用液流刺激，结合毛束的紧密程度来解释以上的现象。他们发现如果如果一簇毛细胞一起收到较为一致的刺激就会产生快速的适应，相反，不一致的刺激会导致较慢的适应。最后Ricci教授总结说，不同的刺激模式会导致毛细胞不同的应激表现，目前该过程不依赖于钙离子，但是仍有一些依赖于钙离子的毛细胞束应激过程仍没有研究清楚。
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左: Robert Fettiplac教授,?右: Anthony Ricci教授
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来自圣路易斯Washington University耳鼻喉系的助理教授Mark A. Rutherford报告题目为“Excitotoxicity and recovery at the hair cell ribbon synapse”向大家介绍了一种噪音导致带状神经突触损伤的的机制。Rutherford教授说，过度暴露在噪音中会导致毛细胞丝带突触的损伤，最终导致神经退化和（年龄相关）的听力丧失。理解耳蜗神经退化的基础是了解噪音触发的突触后神经元兴奋性毒性损伤的机制。Rutherford教授认为这种兴奋性毒性是由谷氨酸能激活听众神经纤维后突出上的AMPA受体导致的。然而，导致神经突触损伤的下游机制目前并不了解，因此，为了解决这一问题，Rutherford教授的团队以Vglut3（the vesicular glutamate transporter in cochlear inner hair cells）的KO小鼠为模型研究噪音和突触损伤的关系。在KO的小鼠中，噪音处理之后，神经突触依然保持完整，可是谷氨酸能导致神经突触损伤的机制又是什么呢？Rutherford教授介绍到他们利用斑马鱼在体电生理和Ca2+成像技术发现毛细胞的激活会导致强烈的Ca2+内流，因此Rutherford教授猜测Ca2+的内流可能是导致突出损伤的原因，但是在KO小鼠中的实验结果却没有显示神经突触的损伤，这说明Ca2+内流不足以破坏突触。他们通过免疫组化分析发现年龄较大的大鼠耳蜗中AMPA上GluA2亚基缺失，该亚基可以抑制Ca2+的流入。此外，他们发现丝带突触上除了表达GluA2外，还有GluA3&4。使用荧光标记手段，Rutherford发现这三种亚基的表达具有不同的密度和占比，而且在某些突触上，三种亚基并没有完全重合表达，这表明突触中存在GluA2缺失的区域，从而允许Ca2+的大量涌入。最后，Rutherford教授总结道，综合以往的研究成果，他们假设AMPA受体激活后产生Ca2+大量流入，从而产生耳蜗中对突触的兴奋性毒性。
清华大学肖百龙教授介绍了他们关于Piezo1蛋白结构的研究，他的报告题目是“In touch with the mechanosensitive Piezo channels: structure, ion permeation, mechano-gating and regulation”。Piezo1是一个具有螺旋桨状的三聚体结构的离子通道，该蛋白的最后两个穿膜区形成了允许离子通过的孔道结构。而且它的N末端上没有穿膜区的序列折叠为桨叶状。肖教授认为，Piezo1是采用模块化的工作机制，作为一个复杂的机械敏感性阳离子通道，它具有两个功能模块，一是分离的孔道模块，另一个是机械力感受模块。
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图左: Mark A. Rutherford教授, 图右: 肖百龙教授
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耳聋是一个常见的疾病，因此听力的损伤和治疗一直是医疗事业的关注重点。来自St. Jude Children’s Research Hospital的发育神经生物学教授Jian Zuo 报告题目是“Drug development for cisplatin- and noise- induced hearing loss”，介绍了一种可以治疗cisplatin和噪音导致的耳聋的药物——K（略称）。 Zuo教授团队筛选了4385种分子，其中他们鉴定出10中在小鼠中能够抵抗cisplatin毒性的组分。其中，K是一种CDK的抑制剂，它能够在斑马鱼、小鼠和大鼠中保护听力免受cisplatin和10-24dB噪音的伤害。他们的实验结果表明，cisplatin会导致ROS反应，而K可以很大程度上降低ROS反应，从而减少毛细胞的损伤。此外，他们还筛选出了其他几种能够药物，有望对听觉修复提供巨大的帮助。
来自Emory University的Xi Erick Lin耳鼻喉系教授介绍了神经感受性耳聋（SNHL）、目前针对该疾病的治疗方法以及他们所致力于推进的生物学治疗手段。他的报告题目是“Biology-based therapies to treat profound deafness”，针对于SNHL，目前主要的治疗手段是使用人工耳蜗和光遗传学技术，然而人工耳蜗有很多的不便，例如它不能分辨音高和声调，容易受到噪音干扰，以及很难感受到讲话者的声音特征和声音中包含的情绪等因素，此外，它还需要患者终身佩戴并经常保养设备，给患者的生活带来诸多不便。因此Lin教授积极推崇生物学治疗方法，生物手法不需要植入任何设备，而且比人工耳蜗能够更好地修复患者的听觉系统，主要针对GJB2和GJB6的包括毛细胞再生、基因治疗在内等手段。
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图左: Jian Zuo教授, 图右: Xi Lin教授
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在这次难得的机会里，十位报告人给我们带来了听觉领域的学术盛宴，本次论坛为北京地区广大师生提供了了解听觉和耳聋的机会，并且让学生能够近距离接触该领域的最新研究成果。会议过程中师生积极互动，热烈讨论了关于该领域的热点问题。本次会议达到了促进了国内外听觉领域的学术交流的目的，将会对耳聋的治疗和相关医学转化领域的研究产生积极的推动作用。
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