尽管氯离子是细胞中最常见的阴离子，但是相对阳离子和相关阳离子通道蛋白，氯离子流及其相关氯离子通道蛋白的生理学功能在很长的时间里没有受到学界重视。1989年，纤维化囊肿的致病基因CFTR被克隆，该基因编码的蛋白属于ABC转运蛋白家族成员，编码一个配体依赖的氯离子通道。1990年，从海洋生物电鳐中克隆到氯离子通道ClC-0，该基因编码的蛋白赋予了电鳐皮肤细胞放电的特性。时隔一年，ClC-0在人类的同源基因ClC-1被克隆，该基因的突变可导致肌强直。这些基因的克隆将跨细胞膜的氯离子流与各种生理现象及人类疾病联系起来，开启了离子通道研究的新篇章。随后三十多年的时间里，多个细胞膜定位的氯离子通道被克隆，包括Bestrophin家族、TMEM16A/B、LRRC8家族、PAC等等，但科学界对细胞器/内膜系统的氯离子通道却知之甚少。

内质网是真核细胞中广泛存在的内膜系统，其主要功能是新生多肽的折叠修饰，脂质合成以及钙库。内质网通过IP3R（三磷酸肌醇受体）和RyR（兰尼碱受体）通道释放钙离子，而通过SERCA质子泵回收钙离子。钙离子跨内质网膜的流动会带来电势的变化，需要其他离子进行电荷的平衡。内质网的钙离子稳态破坏会引发未折叠蛋白反应（unfolded protein responses，UPRs）导致包括神经退行性疾病在内的多种疾病。自1978年以来，使用分离的肌浆网和电生理技术，多个课题组记录到电压门控的钾离子流和直线型I-V（电流-电压）特征的氯离子流，提示在肌浆网上可能存在阴、阳离子两类通道。2007年，Trimeric Intracellular Cation channels （TRICs）被报道是内质网定位的钾离子通道，能影响内质网的钙离子稳态。2001年，利用过表达Chloride Channel CLIC like 1（CLCC1）的CHO细胞的微囊体（microsome）组分，研究者记录到一个全新的阴离子流，但CLCC1是否是内质网氯离子通道的孔道形成（pore-forming）成分依然存疑；此外，细胞膜定位的阴离子通道同样在内质网进行折叠和修饰，所以既往研究者在微囊体检测到的阴离子流也可能是来源于细胞膜定位的通道蛋白。

2023年5月4日，Cell Research在线发表 “Disruption of ER ion homeostasis maintained by an ER anion channel CLCC1 contributes to ALS-like pathologies”， 清华大学医学院教授、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院研究员贾怡昌、中科院上海药物所高召兵和北京大学第三医院樊东升实验室首次证实了CLCC1是内质网定位的氯离子通道的孔道形成组分；从全长序列看，CLCC1与CLIC（Chloride intracellular channel）蛋白序列并无相似性，该研究团队建议根据CLCC1内质网定位特征和电生理数据，将该基因重新命名为ER Anion Channel 1 (ERAC1)；CLCC1调节内质网阴、阳离子稳态；CLCC1的功能缺失会破坏内质网的离子稳态，引发内质网胁迫并参与肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）的病理和致病。

CLCC1的一级序列和任何已知的离子通道都没有相似性，仅预测出信号肽和三个跨膜结构域。免疫荧光实验和生化方法确认了CLCC1在内质网的定位。使用纯化的CLCC1蛋白进行单通道电生理检测，该研究团队证实CLCC1可以独立介导阴离子流，但不通透钠、钾、钙等阳离子。CLCC1的通道活性可以通过半胱氨酸350位点（C350）被小分子MTSET和DIDS抑制，而C350F的突变不影响电流但可解除以上两种药物的抑制现象，提示C350位点靠近CLCC1氯离子通道的孔道区。生化实验揭示了CLCC1拓扑结构，即保守的N端和第二个成环区在内质网腔侧。电生理实验表明N端的D25和D181对于钙离子抑制通道活性极其重要，这与内质网腔侧高浓度的钙离子水平相契合，提示一种全新的钙抑制的通道活性的调控机制。

为了研究CLCC1是否参与调节内质网的离子稳态，该研究团队首先制备了内质网定位的比率型（ratiometric）氯离子探针和钾离子探针。他们发现，敲低CLCC1（敲低效率达到50%或者以上）导致静息态内质网中氯离子浓度（[Cl^-]_ER）和钾离子浓度（[K⁺]_ER）升高。透射电镜结果表明，不同于正常细胞中出现的细长的内质网结构，CLCC1敲低的细胞出现更多的短棒状内质网，且内质网的平均宽度会明显增加。因此，CLCC1维持着内质网中氯离子浓度和钾离子浓度，以及内质网渗透压相关的内质网形态。

内质网定位的离子通道可以通过离子对冲（counter-ion）的机制来平衡内质网钙离子释放（内钙释放）所产生的内质网内外的电势差。通过IP3R、RyR和TRICs的钾离子流不可能同时平衡内钙释放所造成的电势和渗透压的变化。CLCC1介导的氯离子流可以通过2Ca²⁺ + Cl^- = 3K⁺的方式，完美地平衡钙释放所造成的电势和渗透压的变化。该研究组发现CLCC1敲低的细胞不仅显著的降低了钙释放的幅度和释放的速度，还削弱了细胞质中的钙震荡，提示CLCC1正是业内长期寻找的2Ca²⁺ + Cl^- = 3K⁺中的内质网阴离子通道成分。在原代心肌细胞中，CLCC1功能缺失也削弱了咖啡因刺激的RyR通道介导的钙释放。以上实验表明，CLCC1对内质网/肌浆网钙释放的影响不限于特定的钙通道。使用低亲和力内质网定位的钙离子探针，该研究团队发现敲低CLCC1水平至～80%而非～50%会显著降低内质网钙离子浓度（[Ca²⁺]_ER），提示CLCC1剂量依赖性影响[Ca²⁺]_ER，而这种影响很可能是由于CLCC1功能缺失造成的内质网体积增大所引起。

该研究团队进一步发现磷脂酰肌醇【PI(4,5)P2】可以增加CLCC1的电导，还可以增加其开放概率。PI(4,5)P2对CLCC1活性的促进依赖于CLCC1第二个成环区一个保守的赖氨酸位点（K298）。K298A突变的蛋白虽然还有通道活性，但完全丢失了PIP2对CLCC1电导和开放概率的促进作用。在细胞中诱导表达K298A突变的CLCC1削弱了内钙释放和随后的钙震荡。K298A突变敲入不仅在小鼠小脑增加内质网胁迫和内质网膨胀，而且在脊髓中减少ChAT+运动神经元数量。以上结果表明，CLCC1通道活性的改变能破坏内质网离子稳态和损害内质网形态，并最终导致神经元的死亡。

该研究团队在中国ALS队列中（670 病人和1910对照）发现了CLCC1上8个罕见突变包括W267R和S263R。其中，S263R突在两个没有亲缘关系的病人中被发现。值得一提的是，W267和S263相对保守，存在于同一个alpha螺旋，都突变为赖氨酸，提示ALS的W267R和S263R突变对CLCC1功能的影响可能是相似的。通过单通道电生理，钙成像，突变敲入小鼠的病理学检测等一系列实验，他们证实S263R和W267R为功能缺失的突变。低剂量腹腔注射衣霉素（tunicamycin，一种诱导内质网应激药物）能在CLCC1突变敲入小鼠的脑中引起神经元的内质网胁迫，而同样浓度的衣霉素不能在正常小鼠脑内引发内质网胁迫，表明CLCC1的ALS突变可能通过削弱病人应对胁迫的能力而致病。在K298A，S263R和W267R三个突变敲入小鼠品系中，突变的CLCC1蛋白会发生泛素化依赖的降解，提示ALS突变的CLCC1不能有效组装到CLCC1通道多聚体中而降解。在脊髓ChAT+运动神经元中条件性敲除Clcc1，引起运动神经元大量死亡，运动神经元内质网胁迫，和ALS特征性病理，包括TDP-43蛋白出核和TDP-43泛素化聚集。以上结果首次将CLCC1的突变与ALS联系起来，并提示CLCC1可能是一个新的ALS致病基因。

该研究首次证实了CLCC1是内质网定位的氯离子通道的孔道形成组分；CLCC1可能是业内长期寻找的内质网阴离子通道成分，通过2Ca²⁺ + Cl^- = 3K⁺的方式平衡钙释放所造成的电势和渗透压的变化；通过与临床医生的合作，首次提出CLCC1是一个新的ALS致病基因，并通过研究CLCC1的功能缺失提出ALS致病的新机制，包括CLCC1的功能缺失激活经典的ATF4和ATF6而非IRE1/XBP1通路。

内质网定位的阴离子通道CLCC1/ERAC1调节内质网离子稳态

清华大学生命科学学院院/生命科学联合中心毕业生郭亮博士，中科院上海药物所毛琼蕾博士，北京大学第三医院何及博士是论文的并列一作。清华大学医学院/生命科学联合中心贾怡昌教授，中科院上海药物所高召兵研究员，北医三院樊东升教授是并列通讯作者。清华大学药学院肖百龙教授和刘晓玲博士，清华大学医学院朴学娇博士，清华大学脑与智能实验室罗莉博士，宋强博士，清华大学生科院本科生于涵之，中科院上海药物郝晓旭均有重要贡献。本工作获得了北大-清华生命科学联合中心、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院、国家自然科学基金、和北京市科委等支持。