2024年4月17日，清华大学精密仪器系、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院孔令杰课题组与合作者在Nature Photonics以长文的形式在线发表了题为“Random-access wide-field mesoscopy for centimetre-scale imaging of biodynamics with subcellular resolution”的研究论文。该研究针对大尺度在体生物动态观测的迫切需求，研发了具有 12.8×12.8 mm² 视场、 ∼2.2 µm 横向分辨率的随机扫描宽视场层析显微系统，并成功应用于正常生理和病理状态下小鼠大脑及脊髓的动态功能成像。

受到固有空间带宽积的限制，传统光学显微系统中成像视场与空间分辨率互相制约，难以满足神经科学、免疫科学等生物医学研究对于宽视场、高时空分辨率动态观测的应用需求。尽管近期人们提出了几种新型中尺度显微系统，但这些系统通常需采用定制化物镜等光学元件，极大地增加了系统成本。此外，基于单光子荧光的中尺度显微系统中存在严重的焦外背景干扰问题，不仅降低了成像深度，还极易引入伪信号。实际应用中，还需注意的是，若中尺度显微系统的成像视场与生物样本的尺寸不匹配，则意味着存在数据传输及存储资源的浪费。

针对上述难题，本研究开发了具有厘米尺度视场、微米级分辨率的随机扫描宽视场层析(RA-WiFi)显微系统，可根据目标区域的位置、形状及尺寸灵活设定成像区域，满足大尺度生物动态高时空分辨率观测的应用需求。RA-WiFi介观显微系统通过采用具有高空间带宽积的商用物镜，并设计子视场扫描成像策略进行高空间分辨率采样，成功实现了兼顾宽视场和高空间分辨率的介观尺度显微成像。进一步地，通过引入低视场角模式，将成像视场面积扩大到所选物镜标称成像面积的5倍，达到 163.84 mm²。针对系统中存在的光学像差，RA-WiFi介观显微系统通过引入基于无波前探测器的自适应光学技术，将系统横向分辨率（∼2.2 µm）保持在亚细胞水平。

图1. RA-WiFi介观显微系统结构图

RA-WiFi介观显微系统可实现明场显微、暗场显微、多色荧光显微等多模态成像。例如，采用明场显微模式对12.8×12.8 mm²尺寸的集成电路芯片进行高空间分辨率、高数据通量（15668像素×15668像素）检测，耗时仅需1.02秒(图2(a))。RA-WiFi介观显微系统所支持的视场足以覆盖两张完整的鼠脑切片，文中展示了荧光显微模式下，两张鼠脑切片中亚细胞结构（如树突等）的快速成像(图2(b-d))。

针对单光子荧光显微存在的焦外背景干扰难题，RA-WiFi介观显微系统通过引入结构光层析模块，有效抑制了焦外背景，提升了成像的对比度(图2(c,d))。与常规显微成像方法相比，RA-WiFi系统的层析功能有效消除了神经活动的伪信号，对于在体神经功能网络研究具有重要意义。

此外，针对曲面生物样本（如小鼠大脑及脊髓）成像的迫切应用需求，RA-WiFi介观显微系统通过引入电调谐透镜，实现了可适于生物样本表面形状的多平面成像(图2(e-g))。这一功能还使得RA-WiFi系统在使用中无需进行手动样本调平，解决了大尺度显微成像中样本调平的棘手难题。

图2. RA-WiFi介观显微系统的典型应用。

(a) 明场（紫色）、暗场（绿色）显微模式下集成电路快速检测成像。(b) 两张完整鼠脑切片的荧光层析显微成像。(c,d) 图b中橙色框所示区域在传统宽场荧光显微系统及RA-WiFi介观显微系统下的成像结果。(e,f) 常规成像及多平面成像模式下曲面脊髓的血管成像。(g) 图e,f中虚线框内区域的放大图。(h)气流刺激胡须时大跨度关联脑区随机扫描成像。(i)图h中虚线框内区域中与外加刺激强相关的神经信号示例。(j,k) 不同基因类型神经元在癫痫发作时钙信号传播模式。(l) “多图单曝”策略选定的子视场区域示意图。(m) 传统“单图单曝”模式下经图像分割所得神经元空间分布图。(n) “单图多曝”模式下经图像分割所得神经元空间分布图。

RA-WiFi介观显微系统的上述特性使其在介观尺度生物动态研究中具有显著优势。首先，通过快速切换子视场进行高空间分辨率图像采集，本研究展示了小鼠全脑表面的遍历扫描功能成像和大跨度关联脑区的随机扫描功能成像(图2(j,k))。在随机扫描模式下，文中展示了双区域、双平面的在体神经网络钙信号成像。其次，通过对癫痫发作时小鼠脑皮层活动进行大尺度观测，本研究探讨了不同基因类型神经元的活动差异(图2(j,k))及癫痫状态下的神经血管耦合现象。研究发现，在癫痫发作时，特异性表达Rasgrf和pv基因型的不同神经网络具有显著的钙信号传播差异：在前者中钙波向四周传播，且神经过度活跃状态的持续时间较短（14.7~18.6秒），而在后者中钙波仅向脑中线方向传播，且神经过度活跃状态的持续时间较长（41.7~54.7秒）。上述现象的发现依赖于RA-WiFi系统的宽视场、高时空分辨率特性，有助于揭示癫痫致病机理及探索癫痫干预策略。值得注意的是，RA-WiFi系统的可灵活设定视场区域的特性，尤其适于呈狭长、曲面视场的小鼠脊髓的动态成像，克服了其他介观显微系统中数据传输及存储资源浪费的问题。本研究对小鼠脊髓中血浆灌流及免疫细胞迁徙等生物动态进行了高效信息采集，文中报道了以9.6 Hz帧率对6.5 ×1.7 mm²视场内的曲面脊髓进行高分辨率动态成像。

为了进一步提升RA-WiFi介观显微系统在大尺度成像时的时间分辨率，本研究利用生物动态的时空稀疏特性，提出了“多图单曝”策略，即通过将多个子视场的信息曝光在一帧图像中，降低了相机数据读取耗时对成像帧率的限制。例如，本研究以“双图单曝”模式对小鼠脑皮层中任意两个区域的神经活动及血管舒张进行成像，将成像速度提升了∼25%(图2(l-n))。

综上，RA-WiFi介观显微系统为系统生物学研究提供了强有力的工具，尤其适用于对非常规目标成像区域进行高时空分辨率观测的应用需求。该系统的低器件成本和高成像性能等优势，使其在神经科学、免疫科学等研究中极具应用潜力。此外，RA-WiFi介观显微系统的宽视场、高时空分辨率特性使其还适用于大规模集成电路的高速缺陷检测等领域。

清华大学精密仪器系博士生施汝恒、陈欣玥及清华大学生命学院博士后邓俊豪为本文共同第一作者。清华大学精密仪器系副教授、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院研究员孔令杰、解放军总医院骨科医学部主任唐佩福和副主任医师张里程为本文共同通讯作者。海南大学生物医学工程学院教授周非凡、清华大学精密仪器系博士生梁君浩、清华大学精密仪器系科研助理范奎奎为本项研究做出了重要贡献。本研究受科技创新2030—脑科学与类脑研究重大项目、国家自然科学基金重点项目等资助。