2024年8月19日，清华大学生命科学学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院欧光朔课题组在PLOS Biology杂志发表了题为“AlphaFold2-guided engineering of split-GFP technology enables labeling of endogenous tubulins across species while preserving function”的方法学论文。该研究通过利用人工智能（Artificial Intelligence, AI）软件AlphaFold2的结构预测能力，发展了一种能够在活细胞中对微管蛋白进行低损伤、高效率荧光标记的新技术。

微管的动态不稳定性对其正常生理功能至关重要，这一过程依赖于多种微管蛋白（Tubulin）亚型在微管末端的组装与去组装。微管蛋白的突变与多种人类疾病相关，因此，在活细胞中对微管蛋白进行可视化标记是研究其功能的关键策略，对于理解微管的动态调控以及解析相关疾病的病理机制具有重要意义。然而，现有方法在活细胞内对微管蛋白低损伤、特异性和高效率标记方面存在显著局限，例如，绿色荧光蛋白（GFP）标记会对微管蛋白的功能和定位产生影响，免疫荧光染色则无法研究微管的动态特性，限制了对微管蛋白亚型精确功能的理解以及微管蛋白相关疾病机制的阐释。

该研究利用AI技术AlphaFold2，在split-GFP荧光互补标记技术的基础上进行了关键改进。研究团队首先将16个氨基酸的GFP11短标签精准插入至α-或β-微管蛋白的非保守H1-S2 loop区，然后利用AlphaFold2进行结构预测，优化了GFP11两端的linker序列，确保GFP11与GFP1-10互补片段之间的稳定互作，从而产生稳定的荧光信号（图A）。结构匹配和分子模拟结果表明，该策略（GFP11-i）成功地将split-GFP蛋白标记在微管的中空管腔内侧，既不影响微管蛋白的折叠成熟过程，也不破坏微管的整体结构与基本功能（图B）。进一步，该研究在秀丽隐杆线虫中采用基因敲入策略，对内源的α-或β-微管蛋白进行了GFP11-i标记。结果显示，与传统的GFP标记方法相比，GFP11-i标记对体内如胚胎分裂、纤毛发生等与微管相关的重要生物过程的干扰更小，同时实现了对内源微管蛋白亚型的组织特异性标记，并且能够对突变微管蛋白进行高保真（低损伤）的活体标记与动态示踪。通过在人源细胞系和小鼠卵细胞中转基因表达GFP11-i标记的人类/小鼠微管蛋白（图C），该研究展现了GFP11-i在哺乳动物系统中的高标记效率，提示了其在微管蛋白相关疾病研究中的重要应用潜力与价值。

图A. 通过AlphaFold2对GFP11-i标记策略进行优化，保证GFP11与GFP1-10稳定互作。

图B. GFP11-i标记方法将split-GFP蛋白标记在微管的管腔内侧，因此不会影响其功能。

图C. 使用GFP11-i在HeLa细胞内高效率标记人源α-微管蛋白TUBA1A。

清华大学生命科学学院、清华-IDG/麦戈文脑科学研究院欧光朔教授为本文的通讯作者；清华大学生命科学学院2021级博士研究生许凯铭为第一作者。此外，清华大学生命学院杨雪瑞课题组的李志原，医学院那洁课题组的毛林凡，生命学院欧光朔课题组的郭正阳等同学参与了本项目研究。本工作获得了国家自然科学基金委，国家重点研发计划，以及许凯铭获得的国自然青年学生基础研究项目等的经费支持。